Микробиологические исследования: основные методы

Для изучения микроорганизмов необходимо хорошо знать существующие методы исследования.

Размеры микроорганизмов малы: изучают их популяции или культуры, выращенные при определенных условиях культуры: содержащие микробы только одного вида называют чистой, а культуру, в который присутствует более, чем один вид, – смешанной.
Если в культуре растут 2 вида микроорганизмов, её называют двухкомпонентной.

Основу микробиологических методов составляют две процедуры:

▶ Выделение – изоляция определенного микроорганизма из существующей в природе смешанной популяции.
▶ Культивирование (выращивание микробной популяции в искусственной среде в лабораторных условиях).

Они в принципе одинаковы при изучении:

• вирусов,
• бактерий,
• грибков,
• одноклеточных водорослей,
• простейших,
• мелких беспозвоночных животных.

Содержание скрыть 1Методы культивации 2Способы выделения чистых культур 2.1Метод штрихов 2.2Метод разбавления 2.3Использование специализированных сред 2.4Метод изоляции одиночных клеток 2.5Метод обогащения культуры 2.6Двухкомпонентные культуры 3Необходимые приёмы к микробиологии. 3.1Стерилизация. 3.2Пастеризация.

Методы культивации

Микробы вездесущи и разнообразны, поэтому получение чистой культуры сводится только к тому, чтобы выделить данный вид из смешанной природной популяции микробов. После этого нужно поддержать выделенные организмы, чтобы они продолжили жить и размножаться.

Для разведения микроорганизмов используется 3 типа сосудов: пробирка, колба и чашки Петри. Любой сосуд сначала стерилизуется (должно быть уничтожено все живое): а после внесения исследуемого микроорганизма защищён от загрязнения извне.

Основной источник загрязнения – воздух. Поэтому пересеивают культуры в настольном боксе или в закрытой “чистой комнате”, куда поступает специально обработанный стерилизованный воздух. Все инструменты перед работой тоже стерилизуется, микробный материал вносится стерильной бактериологической петлёй или пипеткой.

Способы выделения чистых культур 

Биологические, основанные на разнице в:

• типе дыхания (метод Фортнера);
• подвижности (метод Шукевича);
• кислотоустойчивости;
• спорообразовании;
• температурном оптимуме;
• избирательной  чувствительности лабораторных животных к бактериям

Механические:

1. Фракционных разведений Л. Пастера
2. Пластинчатых разведений Р. Коха
3. Поверхностных посевов Дригальского
4. Поверхностных штрихов

К самым распространенным методам получения чистых культур можно отнести:

Метод штрихов

Этот метод чаще всего используется для выделения чистых культур бактерий. Небольшое количество смешанной культуры помещают на кончик инокуляционной петли/иглы и рисуют штрихи по поверхности агаровой среды . Последовательные полосы достаточно хорошо “прореживают” инокулят, и микроорганизмы неплохо отделяются друг от друга.

Ключевой принцип этого метода заключается в том, что путем штриховки создаётся градиент разбавления по всей поверхности пластины Петри, когда бактериальные клетки осаждаются на поверхность агара. Из-за этого градиента разбавления образуется область, где осаждается мало бактериальных клеток, и слияния колоний не происходит. В этом случае каждая колония является потомством одной микробной клетки, представляя собой клон чистой культуры. Такие изолированные колонии отбираются отдельно с помощью стерильной инокуляционной петли/иглы и повторно высеваются на свежую среду для обеспечения чистоты.

Метод разбавления

Препарат с микроорганизмами разбавляют  до тех пор, пока различные отдельные микроорганизмы не будут отделены достаточно далеко друг от друга, чтобы после инкубации они образовали видимые колонии, изолированные от колоний других микроорганизмов. Затем изолированную колонию можно асептически “снять” и перенести в новую стерильную среду. После инкубации все организмы в новой культуре будут потомками одного и того же организма, то есть чистой культурой.

Использование специализированных сред

В дополнение к механическим методам выделения часто используются среды с особыми свойствами: селективные, дифференциальные, обогащающие и комбинированные.

1. Селективная среда: содержит агенты, которые будут подавлять рост одной группы организмов, позволяя рост другой. Например, антибиотики колистин и налидиксовая кислота подавляют рост грамотрицательных бактерий, но не рост грамположительных.

2. Дифференциальная среда: содержит добавки, которые вызывают заметное изменение цвета среды при протекании определенной химической реакции. Они полезны для дифференциации бактерий в соответствии с некоторыми биохимическими характеристиками. Другими словами, они указывают, может ли определенный организм выполнять определенную биохимическую реакцию во время своего нормального метаболизма. Такие среды полезны для идентификации микроорганизмов.

3. Обогащающая среда: обогащающая среда содержит добавки, которые усиливают рост определенных организмов. Это полезно, когда организм, который вы хотите культивировать, присутствует в относительно небольшом количестве по сравнению с другими организмами, растущими в смеси.

4. Комбинированная селективная и дифференциальная среда: комбинированная селективная и дифференциальная среда позволяет расти одной группе организмов, одновременно подавляя рост другой. Кроме того, он дифференцирует организмы, реагируя на химические реакции.

Метод изоляции одиночных клеток

С помощью этого метода из смешанной культуры отбирают единственную клетку нужного вида и разрешают ей расти.

Несколько небольших капель сильно разбавленной питательной среды помещают на стерильную стеклянную крышку стерильной пипеткой, подведенной к капилляру. Затем исследуют каждую каплю под микроскопом, пока не найдут такую каплю, которая содержит только один нужный микроорганизм. Эту каплю переносят стерильной капиллярной пипеткой на свежую среду, где он начинает размножаться.

Метод обогащения культуры

Как правило, он используется для выделения тех микроорганизмов, которые присутствуют в относительно небольшом количестве или имеют медленные темпы роста по сравнению с другими видами, присутствующими в смешанной культуре. Микроорганизмы помещают в специально разработанную культурную среду, где состав и специфические условия инкубации благоприятствуют росту желаемых микроорганизмов, но непригодны для роста других видов.

Двухкомпонентные культуры

Иногда по объективным причинам не удаётся выращивать чистую культуру, и тогда получают 2-х компонентную культуру, которая содержит 2 вида микроорганизмов. Использование 2-х компонентных культур – единственно возможный метод поддержания вирусов.

Множество простейших, которые в природных условиях питаются более мелкими микроорганизмами, проще всего поддерживать в лаборатории в виде двухкомпонентной культуры (например, инфузории и амёбы).

вирус под электронным микроскопом

Необходимые приёмы к микробиологии.

Стерилизация. 

Это методы применяются для уничтожения всех форм микроскопической жизни как на поверхности так, и внутри стерилизованных объектов. Стерилизуются питательные среды, посуда, инструменты.

Различают термическую и холодную стерилизацию. В микробиологии применяют следующие способы термической стерилизации: прокаливание в пламени, выжигание, сухо-жаровая стерилизация, стерилизация насыщенным паром под давлением (автоклавирование), дробная стерилизация (тиндализация) и кипячение.

Из методов холодной стерилизации используют стерилизацию фильтрованием, ультрафиолетом, газом и даже радиацией.

Стерилизация питательных сред обычно основана на нагревании материала насыщенным паром при давлении выше атмосферного. Совместное действие высокой температуры и пара обеспечивает особую эффективность данного способа. При этом погибают и вегетативные клетки, и споры. Установлено, что споры большинства микроорганизмов не выдерживают и 5 минутной экспозиции в насыщенном паре при 121 градусов. Но споры некоторых почвенных микробов погибают при 1 атмосфере только через 20 минут.

Стерилизация в автоклавах осуществляется при температуре в пределах 111-138 градусов, от 0,5 до 2,5 атмосфер. Температура и продолжительность автоклавирования питательных сред определяется их соединением, термостойкостью, термолабильностью.

Субстраты, которые легко разрушаются (молоко, желатиновые среды, субстраты, содержащие сахара, витамины стерилизуют при 0,5 атм. 15-30 минут. Среды, содержащие агар стерилизовать труднее, потому что необходимо ждать расплавления агара (что требует вдвое больше времени). Содержащиеся в почве споры отличаются термостойкостью (её стерилизуют 2 часа или 2 дня подряд по 1 часу, а иногда – 2 часа при 2 атмосферах).

Дробная стерилизация (тиндализация).

Этот метод, введённый в практику английским ученым Тиндалем, применяют для стерилизации сред, портящихся под действием температур выше 100 градусов. Принцип заключается в следующем: прогревают среду и ее компоненты без избыточного давления несколько раз, и в период между прогреваниями дают прорасти жизнеспособным спорам. Возникающие из спор клетки погибают при следующем прогревании, не успев образовать новые споры. Прогревание осуществляется в парах кипящей воды, то есть при температуре 100 градусов текучим паром.

Стерилизация фильтрованием.

Она применяется для субстратов, которые не переносят нагревания. К примеру, это жидкие среды и растворы с содержанием термолабильных белков, витаминов, сахаров, некоторых антибиотиков, а также сыворотки, летучие вещества.

Способ заключается в пропускании жидкостей через специальные мелкопористые фильтры, которые называются бактериальными. Их делают из различных материалов. В соответствии с разным назначением, они отличаются по форме и диаметру пор, их выпускают под определенными номерами и марками.

Мембранные фильтры делают на основе нитроцеллюлозы, асбестовые фильтры (фильтры Зейтца)- из смеси асбеста с целлюлозной, фарфоровые – из смеси кварцевого песка и каолина, прокаленных на огне. Бывают ещё фильтры из диатомитовой (инфузорной) земли: их готовят из диатомина или кизельгура, останков древних одноклеточных водорослей.

Пастеризация.

Однократный прогрев материала при температуре ниже 100 градусов, направленный на уничтожение вегетативных форм микроорганизмов. (прием предложен Пастером).

Пастеризация не обеспечивает абсолютной стерильности субстрата. В результате пастеризации погибает примерно 99-99,5 процентов микрофлоры. Уцелевшие микроорганизмы оказываются заметно ослабленными и размножаются медленно.

Пастеризация широко применяется в пищевой промышленности для обработки продуктов, которые теряют вкусовые и питательные качества при кипячении: молоко, ягодные и фруктовые соки, вина, пиво.

В микробиологии пастеризацией часто пользуются для получения накопительных и чистых культур спорообразующих бактерий и для выявления способности бактерий к образованию спор.

Пастеризацию проводят при 60-75 градусов в течение 15-30 или минут при 80 градусах 10-15 минут, иногда нагревают материал до 90 градусов и сразу же охлаждают.